Рейтинг@Mail.ru
Поиск
x
Журнал №191, август 2019
Журнал №70, июнь–август 2019
Это новый сайт National Geographic Россия. Пока мы работаем в режиме бета-тестирования.
Если у вас возникли сложности при работе с сайтом, напишите нам: new-ng@yasno.media
Палеонтология

Как прочесть ДНК древнего медведя

Алёна Литвиненко, «Наука в Сибири»
06 июля 2017
/upload/iblock/0bf/0bfedb38a93ccc6095cbfb87e72fbc77.jpg
Фото: wikipedia.org
На столе – раствор с генетической пробой. В ней плавает ДНК древнего медведя, а также ДНК тех, кто съел его, жил в нем, выкопал из-под земли и принес в лабораторию. Как отделить нужные молекулы от примесей и восстановить код?
Древнюю ДНК можно добыть из костных останков, зубов, мумифицированной ткани, шерсти, перьев, скорлупы, зерен растений. В этом ученым помогает так называемая полимеразная цепная реакция — экспериментальный метод, позволяющий повысить концентрацию нуклеиновой кислоты в биологической пробе. 

Впервые древняя ДНК была выделена в 1984 году из музейного экспоната квагги – родственника зебр и лошадей, истребленного почти 140 лет назад.

/upload/iblock/4ac/4aceced1463f75fea6a309c158de1756.jpg
wikipedia.org
 Квагга в Лондонском зоопарке, 1870 год.

Поначалу методы были малоэффективны, но постепенно совершенствовались. Ученые начали исследовать ДНК вымерших млекопитающих, динозавров и даже организмов, заключенных в янтаре. Научный мир с оптимизмом воспринял эти работы, однако серьезным препятствием для экспериментов стали контаминации – случайное загрязнение объекта чужеродной ДНК.

— Например, динозавры в итоге оказались ближайшими родственниками куриц — хотя, скорее всего, кто-то из лаборатории в этот день ел курятину, — рассказывает младший научный сотрудник лаборатории сравнительной геномики ИМБК СО РАН Анна Сергеевна Дружкова. — Подобные ошибки связаны с тем, что полимеразная цепная реакция лучше идет на ДНК из современных образцов — ведь у них можно взять кровь или мышечную ткань, и они не подвергались длительному воздействию разрушающих факторов.

Тот, у кого есть специальное оборудование и навыки, может прочитать генетический код словно книгу, однако древние образцы зачастую напоминают разорванные книги или обрывки страниц с нечитаемыми строками. Иногда в образце просто не сохраняется ДНК — остается только свалка из того, что было рядом: информация о почве, грибах и бактериях, которые питаются останками, или людях, откопавших образец.

В идеальных условиях ДНК сохраняется тысячелетиями, но далеко не каждый образец попадает на полку холодильника с температурой -74 °C. Поэтому ученые прежде всего обращают внимание на образцы из вечной мерзлоты (например, мамонтов) либо из пещер с сухим микроклиматом, благодаря которому организм мумифицировался.

— В наших исследованиях были костные образцы, которые прошли через пищеварительный тракт гиен, что тоже воздействовало на ДНК, — добавляет Анна Дружкова. — Чтобы отличить, выделили ли вы ДНК из искомого образца, сидевшего рядом ученого или собаки, которая дома потерлась об его ногу, были придуманы строгие критерии аутентичности. Они подразумевают работу в лабораториях в специальном скафандре, обработку всех поверхностей специальными составами-деконтоминаторами и смену перчаток при каждом соприкосновении с новым образцом.

/upload/iblock/4c8/4c835d81968b9ca867c7e6e73776f9aa.jpg
Аннa Дружковa
Составляя геномную библиотеку, важно помнить, что древняя ДНК деградирует и может содержать от 70 до 120 пар нуклеотидов, в то время как в современной их около 1000 (даже в самом мелком фрагменте). Поэтому крупные «цепочки» можно с уверенностью исключать.

— Когда мы начали свои работы с древней ДНК, возник вопрос, где брать образцы, и здесь нам помог Институт археологии и этнографии СО РАН, — продолжает Анна Дружкова. — В нем есть коллекции костей различных млекопитающих, с помощью которых реально восстановить эволюционную историю какого-либо вида. Для нашего исследования были взяты образцы медведей — бурых и вымерших малых пещерных. Насчет последних возникло много споров: другие генетики уже исследовали костные образцы с Алтая и утверждали, что там обитали только бурые медведи. Однако наши коллеги показали, что на Алтае жили и другие виды.

Часть образцов была взята из Денисовой пещеры — места, где благодаря микроклимату хорошо сохраняется ДНК. Также использовались кости, вымывшиеся на берега сибирских рек Чумыш и Чик. Возраст образцов оттуда составил примерно 32 000 лет, и, несмотря на то, что кости почернели и плохо сохранились, современные методы позволили получить митохондриальный геном даже из них. 

Митохондриальная ДНК находится внутри митохондрий – органоидах в цитоплазме клетки. Молекулы ядерной ДНК скрыты в хромосомах внутри ядра. – Примечание NG Россия. 

— Чтобы выделить ДНК, мы используем широко распространенный способ, — поясняет Анна Дружкова. — Для начала убираем верхний слой кости (где больше всего контаминаций) с помощью алмазного диска, измельчаем небольшой фрагмент в пудру и растворяем в специальном растворе, очищая от препятствующих ПЦР загрязнений. Естественно, из древнего образца выделяется всё, что находилось рядом: грибы, бактерии, люди.

Содержание митохондриальной ДНК в образце невелико, так как определенный процент занимает ядерная ДНК и разные контаминации. Поэтому ученые используют протокол обогащения с помощью фрагментов из ДНК современного образца этого же либо близкородственного вида. К современной ДНК, как к магниту, притягиваются наиболее похожие фрагменты древней, содержащие уникальные коды — словно одинаковые бирки, по которым в ходе анализа можно отсортировать все последовательности из древнего образца и не спутать с современным, взятым для обогащения. Таким образом из всей смеси ДНК из древнего образца ученые «вытягивают» искомые митохондриальные фрагменты.

— Бурые медведи, которые фигурировали в нашем исследовании, действительно относятся к бурым, без погрешностей, — подчеркивает исследовательница. — То же самое с пещерными. Это важный результат: ведь молекулярно доказано, что на территории Западной Сибири обитали представители разных видов из семейства медвежьих.

Благодаря очистке от контаминаций и обогащению библиотек для секвенирования ученым удалось собрать митохондриальные геномы и проследить эволюционные взаимосвязи между разными представителями медвежьих.

История такова: в ходе последнего ледникового периода (26–19 тыс. лет назад) сравнительно небольшая группа бурых медведей расселилась по всей Евразии.

Исследователям из ИМКБ СО РАН удалось показать, что на территории Сибири жили представители из более ранних миграционных волн, следы которых остались в современных популяциях медведей Японских островов и Аляски.

Так, алтайские медведи из раскопа Колывань возрастом в 3 500 лет и из Денисовой пещеры возрастом в 5 000 лет входят в заключительную волну мигрантов, расселившихся в последние 10 000 лет, а медведь с реки Чумыш, которому 32 000 лет, относится к предпоследней миграционной волне, прошедшей 30–50 тысяч лет назад.

/upload/iblock/a44/a4488583f6b6e8c1791d9ea8249afcb0.jpg
Аннa Дружковa
— Еще у нас был медведь возрастом около 32 000 лет с реки Чик, — рассказывает Анна Дружкова. — Он также принадлежит к группе бурых медведей, наиболее близких к современным белым и бурым, которые сейчас встречаются на островах Адмиралтейском и Баранова. Когда мы поняли, что данных по современным медведям в Сибири недостаточно, так как территория очень большая, коллеги поделились с нами современным образцом из Иркутска. Мы сделали по нему обогащение, и выявили, что он тоже относится к этой уникальной группе из предпоследней миграционной волны, — один из современных медведей оказался с таким уникальным гаплотипом!

По ранее полученным расчетам общий предок с бурыми и пещерными медведями жил около трех миллионов лет назад. На основании исследования ученых из ИМКБ СО РАН можно утверждать, что бурые медведи, которые существовали на территории Сибири, были очень разнообразны, и их следы реально найти по всему современному ареалу обитания.

Самыми первыми от общего предка отделились американские и тибетские медведи, а потом уже пещерные, белые и следом — все бурые. На многие преобразования повлияли климатические изменения и ледниковые периоды, поэтому ареалы обитания бурых и белых смешивались. Однако уже 700 000 лет назад белые были самостоятельным видом.

По митохондриальной ДНК также прослеживается родство бурых медведей с белыми, однако если смотреть на ядерную, становится ясно, что белые — однозначно более ранняя отделившаяся ветвь. Пока нельзя сказать, что малые пещерные медведи — отдельный вид среди пещерных, но можно точно утверждать, что они отличаются от бурых.